유전자 발현 분석과 기능 결정은 어떻게 이루어질까?(RT-PCR,DNA microarray,CRISPR-Cas9 등)

저번 글에서는 DNA 클로닝과 PCR이 무엇이고, 클론된 유전자를 어떻게 이용하는지에 대해 배웠습니다. 이번 글에서는 유전자 발현 분석과 기능 결정에 대해 알아보겠습니다.

유전자 발현과 기능 연구 위한 DNA 기술 이용

-유전자 발현 분석하기

 다세포 생물의 여러 세포 형태 등을 이해하기 위해서는 그 세포에서 어떤 유전자들이 발현되는지를 알아야 합니다. 가장 직접적인 방법은 일반적으로 만들어지는 mRNA를 확인하는 것입니다. 먼저 단일 유전자 발현 연구를 예시로 들어보겠습니다. 초파리 배아 발달에 중요하다고 여겨지는 유전자를 클로닝했을 때, 배아의 어떤 부분에서 해당 mRNA가 발견될지 알아야 합니다. 추적 가능한 상보적 서열을 가진 분자를 이용해 핵산 혼성화를 하면 그 mRNA를 추적할 수 있습니다. 핵산 탐침(nucleic acid probe)은 상보적으로 결합하는 짧고 단일 가닥인 핵산을 의미합니다. 분리한 유전자를 주형으로 사용하면 mRNA에 상보적인 탐침을 형광으로 표지하여 합성할 수 있으며, 생명체 내의 장소에서 mRNA를 볼 수 있습니다. 이를 제자리 혼성화(in situhybridization)라고 합니다.

 다른 mRNA 탐지 기술에는 역전사효소-중합효소연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)이 있습니다. 이것은 mRNA를 염기서열이 일치하는 이중가닥 DNA로 전환하면서 시작됩니다. 첫 번째 단계에서는 역전사효소가 각 mRNA 분자의 역전사체인 단일가닥의 DNA를 만듭니다. DNA 가닥 합성을 위한 프라이머로서 상보적 가닥의 타이민 디옥시리보뉴클레오타이드(poly-dT)를 사용할 수 있습니다. mRNA의 효소분해 후에 첫 번째 DNA 가닥과 상보적인 두 번째 DNA 가닥이 DNA 중합효소에 의해 합성되어 이중가닥인 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)가 만들어집니다. 그 다음 단계는 PCR 단계로, 특정 이중가닥 DNA를 많이 복제해 냅니다. 이 경우 초파리 관심 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 수행됩니다. 그 다음 젤 전기영동에서는 특정 초파리 유전자로부터 전사된 mRNA를 가지고 있는 시료에서만 증폭된 DNA 산물을 확인할 수 있습니다.

 그렇다면 유전체 수준의 발현 연구는 어떻게 이루어질까요? 바로 DNA 마이크로어레이 분석법(DNA microarray assays)이 있습니다. 이것은 많은 단일 DNA 가닥들을 소량으로 유리 슬라이드 위에 격자형으로 배열해 고정한 것으로, DNA 칩이라고도 불립니다. 세포의 mRNA는 cDNA로 역전사되고, 형광 표지가 추가되어 cDNA가 마이크로어레이의 탐침으로 사용될 수 있습니다. 현재는 신속하면서 저렴한 DNA 염기서열 분석 방법들이 있어 마이크로어레이의 사용은 줄고 있습니다. 즉 여러 조직이나 다른 배아 단계의 cDNA 샘플을 간단하게 서열해서 어떤 유전자가 발현되는지 알 수 있습니다. 이것은 실제로 서열화된 cDNA이지만 RNA 염기서열 결정(RNA-seq)이라고 불립니다. RNA-seq에서는 mRNA 샘플을 분리하고 더 짧은 크기로 비슷하게 잘라 cDNA로 전환시킵니다. 이 cDNA는 순서가 정해지고, 컴퓨터가 이들을 재배열해서 해당 종의 유전체에 지도화하거나 여러 RNA의 중첩 순서에 따라 순서를 처음부터 정합니다. RNA-seq는 마이크로어레이보다 여러 장점이 있습니다. 첫 번째로, 절차는 표지된 탐침과의 혼성화를 기반으로 하지 않기 때문에 유전체 서열 가진 것에 의존하지 않습니다. 두 번째로, 마이크로어레이와 달리 넓은 범위의 발현 수준을 측정할 수 있습니다. 세 번째로, 신중한 분석은 특정 유전자의 발현에 대한 풍부한 정보를 제공합니다.

-유전자 기능 결정하기

 관심 유전자를 확인한 후에 그 유전자의 기능은 어떻게 찾는 것일까요? 일반적으로는 유전자의 기능을 손상시켜 손상된 세포나 생명체의 변화를 관찰하는 것입니다. 시험관내 돌연변이 유발(in vitro mutagenesis)에서는 특정 돌연변이가 복제된 유전자에 도입되고 돌연변이된 유전자는 동일 유전자의 정상 세포 복제를 막습니다. 돌연변이가 유전자 산물의 기능을 손상시킨다면, 표현형은 결손된 정상 단백질의 기능을 밝히는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 생물학자들은 CRISPR-Cas9 시스템이라는 유전자 편집 기술을 개발했습니다. Cas9은 박테리오파지 감염으로부터 세균을 보호하는 데 도움이 되는 세균 단백질입니다. 이것은 세균의 CRISPR 영역에서 만들어진 guide RNA와 함께 작용합니다. Cas9은 이중가닥 DNA를 절단하는 핵산분해효소입니다. Cas9 단백질은 gudie RNA에 상보적인 DNA 서열의 두 가닥을 절단합니다. 이에 Cas9 유도 RNA 복합체를 바꾸려는 세포에 도입하면 Cas9의 기능을 이용할 수 있습니다. 따라서 유전자를 제거하여 그 유전자의 역할을 연구하는 데 효과적인 방법입니다. 또한 CRISPR-Cas9 기술을 수정해 돌연변이 유전자를 복구할 수 있도록 하기도 했습니다. 정상적인 유전자의 일부를 같이 도입하면 Cas9이 표적 DNA를 절단하고 복구효소는 정상 DNA를 주형으로 절단지점에서 표적 DNA를 복구할 수 있습니다. 

 선택된 유전자의 발현을 억제하는 또 다른 방법으로는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 이용합니다. 특정 염기서열에 일치하는 이중가닥 RNA를 합성하고 세포에 도입해 mRNA를 파괴하거나 RNA의 번역을 막습니다. 이것은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하는 것보다는 빠르지만 유전자 발현의 일시적인 감소를 유발합니다. 질병이나 장애를 일으키는 유전자를 추적하는 데 가장 유용한 유전적 표지자들 중에는 인간 집단 유전체들의 단일 염기쌍 변화들이 있습니다. 어떤 변이가 집단에서 1%보다 많이 있으면 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)라고 합니다. SNP는 100~300개의 염기서열마다 1개씩 있으며, 마이크로어레이나 RNA-seq, PCR를 이용해서 발견 가능합니다. SNP는 주로 단백질 비암호화 부위에 있으며 이 자체는 병의 원인도 아닙니다. 그러나 SNP와 유전자의 거리가 가깝다면 배우자 형성 시 표지자와 유전자 간의 교차가 거의 안 일어납니다. 따라서 표지자는 해당 유전자의 일부분이 아닌데도 거의 항상 같이 유전됩니다. 이렇게 이번 글에서는 유전자 발현 분석과 기능 결정에 대해 알아보았습니다. 다음 글에서는 복제된 생물체와 줄기세포의 이용, DNA 생명공학 기술의 응용에 대해 공부하겠습니다.