DNA 클로닝과 PCR, 클론된 유전자의 발현은 무엇일까?

저번 글에서는 종자식물의 특징에 대해 알아보았습니다. 이번 글에서는 DNA를 이용한 기술에 대해 공부해 보겠습니다.

DNA 염기서열 결정과 DNA 클로닝

-DNA 염기서열 결정

DNA 기술의 핵심은 서로 다른 핵산 분자의 각 가닥의 상보적인 염기들이 염기쌍을 형성하는 핵산 혼성화법(nucleic acid hybridization)입니다. DNA 한 분자의 완전한 뉴클레오타이드 염기서열을 결정하기 위해 상보적인 염기쌍의 원리를 이용하는 것이 DNA 염기서열 결정(DNA sequencing)입니다. DNA는 처음에 절편으로 잘리고, 각 절편의 염기서열이 결정됩니다. 첫 번째 자동화 과정은 디데옥시 리보뉴클레오타이드 사슬종결 염기서열 결정이라는 기술을 사용합니다. DNA 절편의 한 가닥은 구간이 설정된 상보적 절편의 합성 위한 주형으로 사용되고, 그 절편들은 염기서열 결과를 내려고 추가적으로 분석되었습니다. 기술이 더 발전되어 DNA 절편들은 많은 수의 같은 절편을 생산하기 위해 증폭됩니다. 각 절편의 특이적 가닥은 고정되어 있고, 상보적 가닥은 한 번에 한 뉴클레오타이드씩 만들어집니다. 합성 기반 염기서열 결정(sequencing by synthesis)은 4개의 뉴클레오타이드 중 어떤 것이 첨가되는지를 확인하는 것입니다. 차세대 염기서열 결정에서는 DNA를 절편으로 자르거나 증폭하지 않습니다. 단일의 긴 DNA 분자 자체로 염기서열 결정이 이루어집니다. 이렇듯 발전된 DNA 서열화 기법들은 여러 기초생물학적 질문들의 탐색을 가능하게 합니다.

-하나의 유전자 또는 다른 DNA 조각으로부터 다수의 복제물 만들기

 DNA 클로닝(DNA cloning)은 특정 유전자를 직접 연구하기 위해 잘 알려진 DNA 조각 부분을 동일하고 대량으로 만들 수 있는 방법입니다. DNA 절편 클로닝 방법들의 공통된 특징은 대장균 등의 세균을 이용하는 것입니다.  세균의 염색체는 큰 원형의 DNA이며, 대장균 등은 플라스미드(plasmid)라는 염색체로부터 독립적인 원형의 DNA가 있습니다. DNA 절편 클로닝을 위해서는 먼저 플라스미드를 세균에서 분리하고 유전적으로 조작하고 외부의 DNA를 플라스미드에 넣어 재조합 DNA로 만듭니다. 재조합 플라스미드를 세균세포에 다시 넣어주면 재조합 세균(recombinant bacterium)이 됩니다. 이 단일 세포는 세포분열을 통해 유전적으로 동일한 클론(clone)을 복제합니다. 이처럼 어떤 유전자를 대량으로 복제하는 것을 유전자 클로닝(gene cloning)이라고 합니다. 플라스미드는 외부 DNA를 가질 수 있고, 세균세포 내 복제되는 클로닝 벡터(cloning vector) 역할을 합니다. 쉽게 확보 가능하고, 세균세포에의 도입도 쉽고, 외부 DNA를 시험관 내에서 도입 가능하다는 점에서 클로닝 벡터로 잘 쓰입니다. 

-재조합 DNA 플라스미드 제작을 위한 제한효소의 이용

 제한효소(restriction enzyme)는 외부 DNA를 절단하여 세균세포 내로 들어오는 것을 막는 역할을 합니다. 각각은 제한효소자리(restriction site)라는 특정 염기서열을 인지하고 DNA 두 가닥을 자릅니다. 세균들은 이 자리에 메틸기를 첨가해 제한효소로부터 자신을 보호하기도 합니다. 대부분의 제한효소들은 4~8개의 염기를 포함하는 서열을 인식하며, 따라서 다양한 크기의 DNA 분자인 제한효소절편(restriction fragment)을 만들 수 있습니다. 가장 유용한 제한효소는 staggered manner로 DNA 두 가닥의 당-인산 골격을 절단하는 것입니다. 그 결과 양가닥의 제한효소절편들은 점착성 말단(sticky end)라는 단일가닥 말단을 가집니다. 이 부위는 같은 효소로 잘린 DNA의 상보적인 점착성 말단과 일시적으로 수소결합 염기쌍을 만들 수 있습니다. DNA 연결효소에 의해 이 일시적인 결합은 영구적인 결합으로 바뀝니다. 재조합 플라스미드 산물을 확인하기 위해 과학자는 같은 제한효소로 이것을 다시 자릅니다. 젤 전기영동(gel electrophoresis)은 서로 다른 길이의 DNA 절편을 분리, 시각화하기 위한 기술로, 핵산 조각 혼합물을 크기로 분리해 내는 일종의 체입니다. 

-DNA 증폭: 중합효소연쇄반응(PCR)과 DNA 클로닝 이용

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction;PCR)은 유전자 복제에 사용되는 기술입니다. 세 단계의 과정을 반복하면 동일한 DNA 분자 수가 증가합니다. 첫 번째 단계는 반응 혼합물의 DNA 가닥을 분리하기 위해 높은 온도에서 방치합니다. 두 번째는 표적 DNA의 양쪽 말단에 상보적인 서열의 짧은 단일가닥의 DNA 프라이머들이 결합할 수 있게 낮은 온도에 방치합니다. 마지막으로는 DNA 중합효소가 대상 서열과 결합한 프라이머들을 5'에서 3' 방향으로 연장합니다. 여기서 중요한 것은 DNA 중합효소(Taq 중합효소, Pfu 중합효소)가 높은 온도에서도 안정적이기에 이 기술이 가능하다는 점입니다. DNA가 미세한 양으로 있거나 부분적으로는 분해된 상태여도 PCR를 통해 DNA를 증폭할 수 있습니다. 프라이머 서열은 표적서열의 상대편 말단에 있는 3' 염기서열과만 결합하도록 선택됩니다. 각각 순환 과정마다 대상 서열 분자의 수는 2배가 됩니다. 즉, 순환 과정이 n번 반복되면 분자 수는 2^n개가 됩니다. 그러나 PCR 증폭은 유전자가 많을 때는 유전자 클로닝을 대신할 수는 없습니다. 따라서 PCR은 특정 DNA 절편을 만드는 데 더 많이 이용됩니다. 

-클론된 진핵세포 유전자의 발현

 표적 유전자가 클론 되면 암호화하는 단백질을 대량으로 생산할 수 있습니다. 클론 된 유전자는 세균, 진핵세포에서 발현 가능합니다. 이때 진핵세포 유전자를 세균세포 내에서 발현시키는 경우에 유전자 발현 체계가 달라 두 가지 어려움이 발생합니다. 첫 번째는 바로 프로모터와 DNA 조절 서열이 다른 것입니다. 따라서 발현 벡터(expression vector)를 사용해 제한효소 부위의 앞에 강한 원핵생물의 프로모터가 존재하도록 합니다. 세균 세포는 원핵세포의 프로모터를 인식 후 외부 유전자를 발현시킵니다. 두 번째는 진핵세포 유전자가 비암호화된 인트론을 가지고 있다는 것입니다. 인트론은 RNA 염기서열에 남게 되어 유전자의 정확한 발현을 방해합니다. 이것은 엑손만 포함한 유전자인 cDNA를 이용해 해결 가능합니다.

 한편 진핵세포에서는 단세포의 곰팡이인 효모세포가 드물게 플라스미드를 가집니다. 진핵 숙주세포는 진핵세포의 단백질에 번역 후의 변형이 없으면 많은 진핵세포의 단백질들이 기능을 못하므로 유리합니다. 진핵세포 내로 재조합 DNA를 도입하기 위한 방법 중에는 전기천공법(electroporation)이 있습니다. 세포를 포함한 시료에 짧게 전기적 자극을 주어 세포의 원형질막에 DNA가 지나갈 수 있는 구멍을 일시적으로 만드는 것입니다. 또 바늘을 이용해 단일 진핵세포 내로 직접 DNA를 주입할 수도 있습니다. 이렇듯 이번 글에서는 DNA 염기서열 결정 및 클로닝, 제한효소, 클론 된 유전자의 발현 등에 대해 알아보았습니다. 다음 글에서는 유전자 발현 분석 등에 대해 공부해 보겠습니다.